助超进行四因素三水平试验
8、酶辅响应面优化试验设计与结果
（1）响应面试验设计
根据Box-Behnken设计原理，助超进行四因素三水平试验，声提优化酶辅助超声提取阿尔泰金莲花总黄酮的尔泰提取工艺条件。试验结果见表2。金莲以总黄酮提取率为指标，花总黄酮通过Design-ExpertV8.05软件对表中试验数据进行多元回归拟合，工艺获得总黄酮提取率（Y）对酶添加量（A）、研究乙醇浓度（B）、酶辅提取时间（C）和提取温度（D）四因素的助超二次多项回归模拟方程为：Y=18.03-0.15A-0.55B-0.35C-0.12D+0.39AB-0.59A2-0.93B2-0.42C2-0.41D2。
0.43AC+0.018AD-0.42BC+0.012BD-0.072CD
对该模型进行方差分析，声提结果如表3所示，尔泰该回归模型F值14.88，金莲P＜0.0001，花总黄酮方程模型达到极显著；决定系数R2=0.9320，工艺校正系数AdjR2=0.8639；失拟项大于0.05，失拟不显著，说明回归方程拟合状态良好；变异系数C.V为1.63%，表明模型的重现性很好，因此可以利用该模型优化阿尔泰金莲花总黄酮的酶辅助超声提取工艺。由各因素A、B、C、D的F值（或P值）大小可以得出各因素对总黄酮得率影响大小顺序为B＞C＞A＞D。B、C的P值均小于0.01，说明乙醇浓度和提取时间对黄酮提取影响极显著。AB、AC、BC的P值小于0.01，说明酶添加量和乙醇浓度、提取时间，乙醇浓度和提取时间之间有明显的交互作用；而AD、BD、CD的P值大于0.05，表明他们之间的作用对总黄酮提取率没有明显的影响。不同因子交互作用的响应面分析图见图8。通过DesignExpert8.0.5软件分析得出阿尔泰金莲花总黄酮纤维素酶辅助超声提取的最佳工艺条件为:酶添加量1.42%，乙醇浓度47.10%，提取时间38.19min，提取温度39.28℃；在此工艺条件下，阿尔泰金莲花理论预测提取率为18.16%。
（2）验证试验
为检验响应面法优化后的工艺可靠性，考虑实验操作的可行性，结合单因素实验结果，将上述提取工艺条件修正为：酶添加量1.4%，乙醇浓度47.0%，提取时间38.0min，提取温度39.0℃。在此条件下，进行3组平行试验，所得阿尔泰金莲花总黄酮提取率均值为18.02±0.24%，与理论值的相对误差为0.8%，回归方程预测值与实际值相吻合，说明运用响应面法优化得到的模型参数准确可靠，能真实反映各因素对阿尔泰金莲花总黄酮提取率的影响。
三、讨论
本文探讨了纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和中性蛋白酶对超声提取阿尔泰金莲花总黄酮的辅助作用，结果发现它们均能增加总黄酮的提取率，但相比之下，纤维素酶在溶液pH=4时作用最大。在提取过程中，纤维素酶水解可破坏植物细胞的细胞壁，促进了其胞内所含黄酮类化合物的大量渗出，再结合超声的作用，溶液中化合物浓度增大，提取率得到较大提高随着料液比的增大，总黄酮的提取率也不断增大，在1:40以后，提取率不再增加，趋于平缓。基于此，根据Box-Behnken设计原理，选择对提取率影响较大的因素：酶添加量、乙醇浓度、提取时间和提取温度，进行四因素三水平试验，响应面优化阿尔泰金莲花总黄酮的纤维素酶辅助超声提取工艺，最佳提取工艺条件为：pH为4，料液比1:40，超声功率90W，酶添加量1.4%，乙醇浓度47.0%，提取时间38.0min，提取温度39.0℃，在此工艺条件下阿尔泰金莲花总黄酮提取率可达18.0%以上，高于前期回流提取工艺研究获得的提取率17.05%；且该方法简单高效、成本低、易于操作。研究结果可为阿尔泰金莲花及其总黄酮的深入开发提供科学依据。
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